- 低分子柑橘果膠聯(lián)和臨床常用化療藥用于控制癌癥和癌癥轉(zhuǎn)移擴散
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低分子柑橘果膠聯(lián)和臨床常用化療藥用于控制癌癥和癌癥轉(zhuǎn)移擴散
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申請日：2011-01-27申請(專利權(quán))人 范曉青
地址 310003 浙江省杭州市皮市巷210號1單元103室
發(fā)明(設計)人 范曉青 許鵬 劉海鷹 俞仲華
主分類號 61K31/732(2006.01)I
分類號 61K31/732(2006.01)I A61K45/00(2006.01)I
A61P35/00(2006.01)I A61P1/00(2006.01)I A61P1/16(2006.01)I A61P15/00(2006.01)I A23L1/29(2006.01)I
A61K31/704(2006.01)N A61K31/664(2006.01)N
A61K31/495(2006.01)N
公開(公告)號公開(公告)日 102085214A 2011-06-08
專利代理機構(gòu) 杭州豐禾專利事務所有限公司 33214
代理人 王從友(54)發(fā)明名稱
低分子柑橘果膠聯(lián)和臨床常用化療藥用于控制癌癥和癌癥轉(zhuǎn)移擴散
(57)摘要
本發(fā)明涉及一種低分子柑橘果膠的新用途，尤其涉及低分子柑橘果膠用于制備藥品、食品或保健品的應用，該藥品、食品或保健品用于聯(lián)和臨 床常用化療藥用于控制癌癥和癌癥的轉(zhuǎn)移擴散。低分子柑橘果膠聯(lián)和臨床常用化療藥用于控制癌 癥和癌癥轉(zhuǎn)移擴散，所述的癌癥為結(jié)腸癌、肝癌或?qū)m頸癌；所述的臨床常用化療藥為PAC-1、環(huán)磷酰 胺或阿霉素。
1.低分子柑橘果膠用于制備藥品的應用，其特征在于：該藥品用于聯(lián)和臨床常用化療藥用于控制癌癥和癌癥的轉(zhuǎn)移擴散。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的低分子柑橘果-阿霉素膠用于制備藥品的應用，其特征在于：癌癥為結(jié)腸癌、肝癌或?qū)m頸癌。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的低分子柑橘果-阿霉素膠用于制備藥品的應用，其特征在于：臨床常用化療藥為PAC-1、磷酸酰胺或阿霉素。
4.低分子柑橘果膠用于制備食品的應用，其特征在于：該食品用于聯(lián)和臨床常用化療藥用于控制癌癥和癌癥的轉(zhuǎn)移擴散。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的低分子柑橘果膠用于制備食品的應用，其特征在于：其特征在于：癌癥為結(jié)腸癌、肝癌或?qū)m頸癌。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的低分子柑橘果膠用于制備食品的應用，其特征在于：臨床常 用化療藥為PAC-1、磷酸酰胺或阿霉素。
7.低分子柑橘果膠用于制備保健品的應用，其特征在于：該保健品用于聯(lián)和臨床常用化療藥用于用于控制癌癥和癌癥的轉(zhuǎn)移擴散。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的低分子柑橘果膠用于制備保健品的應用，其特征在于：癌癥為結(jié)腸癌、肝癌或?qū)m頸癌。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的低分子柑橘果膠用于制備保健品的應用，其特征在于：臨床常用化療藥為PAC-1、磷酸酰胺或阿霉素。
低分子柑橘果膠聯(lián)和臨床常用化療藥用于控制癌癥和癌癥轉(zhuǎn)移擴散
技術(shù)領(lǐng)域[0001] 本發(fā)明涉及一種低分子柑橘果膠的新用途，尤其涉及低分子柑橘果膠用于制備藥品、食品或保健品的應用，該藥品、食品或保健品用于聯(lián)和臨床常用化療藥用于控制癌癥和癌癥的轉(zhuǎn)移擴散。
背景技術(shù)[0002]天然柑橘果膠是一種多糖復合物（長鏈碳水化合物），也是一種膳食纖維。它由天然柑橘水果如檸檬、柚子、桔子和桔的果皮和果肉中提取獲得。這種多聚糖的長鏈產(chǎn)物有許 多分枝，具有粘附功能。天然果膠是可溶性纖維，食用后不能被腸道吸收。盡管有一些在大腸內(nèi)發(fā)酵，但天然柑橘果膠一般對于人體沒有非常有效的功用。
[0003] 低分子柑橘果膠，其結(jié)構(gòu)式如下：
[0004]低分子柑橘果膠是從天然果膠產(chǎn)物中提取得到的一種以半乳糖為主要成份的多糖，分子量小,無抗原性，水溶性好，容易被胃腸道吸收而進入血液循環(huán)。處理后的果膠分子量明顯小于天然果膠,分子結(jié)構(gòu)也因甲基減少得到改變。它具有與惡性表型細胞親和，粘附特性，特異地殺傷已突變細胞的功能，使突變細胞在未形成之前即被清除。
[0005]申請人申請了專利名稱為：低分子柑橘果膠用于增強免疫功能的應用（專利申請?zhí)枮?00610050803.3）公開了低分子柑橘果膠能明顯改善食欲，增加免疫功能和調(diào)節(jié)免疫紊亂；能降低膽固醇預防動脈粥樣硬化。
[0006]專利名稱為：低分子柑橘果膠用于調(diào)節(jié)血糖血脂和改善脂肪肝中的應用 （200610051667.X）公開了低分子柑橘果膠可延緩糖和脂肪在消化道內(nèi)的吸收，影響膽酸的代謝，間接改變了脂質(zhì)代謝酶的活性，還能促進糖和脂肪在體內(nèi)的代謝，從而降低血糖和血 脂，在吸收而進入血液循環(huán)后，能在體內(nèi)促進肝臟及其它器官中的糖和脂肪分解酶的活性，并降低肝臟及其它器官中的糖和脂肪合成酶的活性，從而達到降低血糖和血脂、治療糖尿病和脂肪肝的目的。
[0007]但是對于低分子柑橘果膠用于控制癌癥和轉(zhuǎn)移擴散的應用還未有公開報道。
發(fā)明內(nèi)容[0008]為了解決結(jié)腸癌治療臨床上常用的化療藥的耐藥及其毒副作用的技術(shù)難題，本發(fā)明一個目的是的目的是提供低分子柑橘果膠的新應用。
[0009]為了實現(xiàn)上述的目的，本發(fā)明采用以下的技術(shù)方案。
[0010]低分子柑橘果膠用于制備藥品的應用，該藥品用于聯(lián)和臨床常用化療藥用于控制癌癥和癌癥的轉(zhuǎn)移擴散。作為優(yōu)選，所述的癌癥為結(jié)腸癌、肝癌或?qū)m頸癌。作為優(yōu)選，所述 的臨床常用化療藥為PAC-1、環(huán)磷酰胺或阿霉素。
[0011]低分子柑橘果膠用于制備食品的應用，該食品用于聯(lián)和臨床常用化療藥用于控制癌癥和癌癥的轉(zhuǎn)移擴散。作為優(yōu)選，所述的癌癥為結(jié)腸癌、肝癌或?qū)m頸癌。作為優(yōu)選，所述 的臨床常用化療藥為PAC-1、環(huán)磷酰胺或阿霉素。
[0012] 低分子柑橘果膠用于制備保健品的應用，該保健品用于聯(lián)和臨床常用化療藥用于用于控制癌癥和癌癥的轉(zhuǎn)移擴散。作為優(yōu)選，所述的癌癥為結(jié)腸癌、肝癌或?qū)m頸癌。作為優(yōu)選，所述的臨床常用化療藥為PAC-1、環(huán)磷酰胺或阿霉素。
[0013]柑橘果膠是一種從柑橘類植物中提取的、以半乳糖為主要單體、具有分支結(jié)構(gòu)的多糖,存在于植物細胞壁中，連接相鄰的細胞。幾乎所有的植物中都含有果膠成分，但蘋 果，柑橘等水果中的含量尤為豐富。低分子柑橘果膠(LCP)是通過特定pH和溫度，酶解CP 而獲得的一種分子量更小、酯化度更低、無分支的果膠多糖。LCP是天然存在的生物信號，是一種類似激素的物質(zhì)，已經(jīng)被證明具有很明顯的免疫調(diào)節(jié)功能，可以激活免疫系統(tǒng)中的白細胞，NK細胞，吞噬細胞等。然而研究發(fā)現(xiàn)CP不能與Galectin-3相互作用,但LCP則是Galectin-3的一個配體且具有極強的親和力。因此，LCP可以作為體內(nèi)Galectin-3配體的競爭性抑制劑。研究證實，當體內(nèi)LCP達到一定濃度時，癌細胞的Galectin-3只與LCP發(fā)生反應，而不再與其配體結(jié)合，從而抑制了Galectin-3的功能表達，繼而阻止了腫瘤的形成。另一方面，對已經(jīng)形成的腫瘤，LCP也可通過將腫瘤細胞表面Galectin-3位點完全封閉而阻止腫瘤細胞從血管獲得營養(yǎng)，抑制其生長、轉(zhuǎn)移,實驗表明LCP在一定濃度內(nèi)能抑制腫瘤生長和肝轉(zhuǎn)移出現(xiàn)，并呈量效依賴關(guān)系。高濃度LCP能有效抑制小鼠結(jié)腸癌的原位生長、肝轉(zhuǎn)移灶的形成。體外實驗證明,LCP具有抑制腫瘤細胞的同型聚集作用,能抑制腫瘤血管生成和腫瘤細胞與內(nèi)皮細胞的粘附作用。
附圖說明[0014]圖1為不同濃度PAC-1對人結(jié)腸癌細胞作用72小時的MTT結(jié)果圖。
[0015]圖2為不同濃度PAC-1處理細胞24h后細胞形態(tài)的變化圖。
[0016]圖3為PAC-1與LCP聯(lián)合應用對細胞增殖的影響圖。
[0017]圖4為IC50濃度的PAC-1單藥及聯(lián)合低分子柑橘果膠處理SW116細胞不同時間后的凋亡比例。
[0018]圖5為IC50濃度的PAC-1單藥及聯(lián)合低分子柑橘果膠處理SW620細胞不同時間后的凋亡比例。
[0019]圖6為不同濃度的PAC-1單藥及聯(lián)合低分子柑橘果膠處理SW116細胞48h后細胞的凋亡比例。
[0020]圖7為不同濃度的PAC-1單藥及聯(lián)合低分子柑橘果膠處理SW620細胞48h后細胞的凋亡比例。
[0021]圖8為為同濃度PAC-1單用及聯(lián)合低分子柑橘果膠處理SW116細胞不同時間后細胞周期變化圖。
[0022]圖9為PAC-1單用及聯(lián)合LCP處理SW116細胞后凋亡相關(guān)蛋白表達的變化圖。
具體實施方式
[0023] 實施例1 結(jié)腸癌是一種常見的惡性腫瘤,細胞轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的重要特征,肝臟是結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移最常累及的器官。除手術(shù)治療外，內(nèi)科治療在結(jié)腸癌的治療中起重要作用。但以目前臨床上的治療效果來看，臨床上常用的化療藥的耐藥及其毒副作用已成為結(jié)腸癌治療的難題。
[0024] 結(jié)腸癌的生長及轉(zhuǎn)移是一個復雜的過程:與細胞分化異常、增值異常、生長失常、癌細胞的生物學特性、機體免疫狀況及肝臟的微環(huán)境有關(guān)，每一個步驟都涉及多種分子事件，對這些分子事件的了解將為結(jié)腸癌及其肝轉(zhuǎn)移灶的預防和治療提供理論依據(jù)。在這些機制中凋亡調(diào)控機制失常而發(fā)生凋亡受阻對癌細胞增值、轉(zhuǎn)移有關(guān)鍵作用。
[0025]結(jié)腸癌分子靶向治療主要分類：(1)針對表皮生長因子受體(EGFR)通道的靶向治療：如西妥昔單抗(cetuximab)；(2)針對血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)及其受體通道的靶向治療：如貝伐單抗(Avastin)；(3)針對其他分子靶點：如caspase凋亡通路的靶向治療、RAS信號通道的靶向治療、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)抑制劑和選擇性環(huán)氧化酶2(COX-2)抑制劑等。
[0026]因此，本發(fā)明以誘導癌細胞凋亡為切入點，通過體內(nèi)、體外實驗，探討從柑橘中提取的低分子柑橘果膠來驗證抑制腫瘤細胞生長的機制。
[0027]本實施例采用PAC-1聯(lián)合LCP對結(jié)腸癌細胞的協(xié)同殺傷作用及其分子機制研究，有助于日后全面認識在誘導細胞凋亡中的地位和意義。
[0028]半胱天冬酶原活化復合物-1（procaspase-activatingcompound-1，PAC-1）是2006年美國伊利諾伊大學P.J.Hergenrother教授領(lǐng)導的研究小組通過篩選25000 多種物質(zhì)后發(fā)現(xiàn)的一種小分子復合物，它能高效活化半胱天冬酶原-3（procaspase-3）轉(zhuǎn)化為半胱天冬酶（caspase-3）并誘細胞產(chǎn)生凋亡。
[0029]的化學結(jié)構(gòu) 分子式為:C23H28N4O2，分子量為:392.5。
[0030]
[0031]對結(jié)腸癌細胞凋亡和增殖的影響
如圖1所示，PAC-1單用對研究的5種人結(jié)腸癌細胞株均表現(xiàn)出明顯的抗腫瘤活性，不同的人結(jié)腸癌細胞株對PAC-1的敏感性存在不同（3-22.7uM），與文獻報道相符。
[0032]PAC-1處理細胞12h后caspase-3表達開始升高，同時PARP及Rock-1的表達也開始升高，各蛋白表達的變化均呈時間依賴性。caspase-8、9的表達隨時間的變化不明顯變化。表明PAC-1直接作用于凋亡途徑下游的凋亡關(guān)鍵執(zhí)行蛋白caspase-3，與文獻報道相符。
[0033] PAC-1作用前后，隨濃度增加細胞增殖周期G0／G1期細胞增加，G2／M、S期細胞減少，具有時間依賴性。說明藥物作用后細胞G1期延長，不增殖細胞群即G1期細胞增多，而G1期延長意味著細胞增殖周期延長，增殖緩慢。
[0034] PAC-1可以通過誘導結(jié)腸癌細胞凋亡和抑制結(jié)腸癌細胞增殖兩條途徑發(fā)揮其抗腫瘤作用。
[0035]聯(lián)合LCP對結(jié)腸癌細胞生長的影響
目前通過細胞和動物模型實驗，證實LCP對黑色素瘤、前列腺癌、乳腺癌和結(jié)腸癌等有生長抑制作用。
[0036] 1、在人結(jié)腸癌細胞中LCP與中高濃度的PAC-1聯(lián)合應用起協(xié)同作用（CI＜1），聯(lián)合用藥組的人結(jié)腸癌細胞的凋亡比例較PAC-1單用顯著增加，表明LCP一方面可以抑制 腫瘤細胞生長，另一方面還能增強小分子靶向復合物PAC-1對人結(jié)腸癌細胞的誘導凋亡作用。
[0037] 2、LCP聯(lián)合PAC-1較PAC-1單用可更有效的使細胞周期調(diào)控失衡，使更多的人結(jié)腸癌細胞停留在G0／G1期，G2／M、S期細胞減少，且具有時間依賴性，說明LCP可以延長細胞的增殖周期。
[0038]3、LCP聯(lián)合PAC-1處理細胞后：Bcl-2蛋白表達變化不明顯，Bax蛋白表達增高，Bax/Bcl-2比值升高，提示LCP增強PAC-1誘導人結(jié)腸癌細胞凋亡的機制可能與調(diào)控這兩種蛋白表達、降低細胞的凋亡抗性有關(guān)。
[0039]LCP聯(lián)合PAC-1處理細胞后較相同濃度相同時間的PAC-1單用caspase-3、表達及下游ROCK-1和PARP的裂解顯著增加，caspase-8蛋白表達的無明顯變化，表明線粒體通路在LCP聯(lián)合PAC-1協(xié)同殺傷人結(jié)腸癌細胞的分子機制中發(fā)揮重要作用。
[0040]一、PAC-1對人結(jié)腸癌細胞的的生長抑制作用，如圖1所示表1-1顯示了不同濃度PAC-1對人結(jié)腸癌細胞作用72小時的MTT結(jié)果，(單位：umol/L)
[0041]二、不同濃度PAC-1處理細胞24h后細胞形態(tài)的變化，如圖2所示。
[0042]三、PAC-1與LCP聯(lián)合應用對細胞增殖的影響 如圖3所示，低濃度的PAC-1與LCP聯(lián)合起拮抗作用CI＞1；中、高濃度的PAC-1與LCP 聯(lián)合起協(xié)同作用CI＜1。
[0043]四、PAC-1單用及聯(lián)合LCP處理細胞后細胞凋亡比例的變化 圖4為IC50濃度的PAC-1單藥及聯(lián)合低分子柑橘果膠處理SW116細胞不同時間后的凋亡比例；
圖5為IC50濃度的PAC-1單藥及聯(lián)合低分子柑橘果膠處理SW620細胞不同時間后的凋亡比例；
圖6為不同濃度的PAC-1單藥及聯(lián)合低分子柑橘果膠處理SW116細胞48h后細胞的凋亡比例；
圖7為不同濃度的PAC-1單藥及聯(lián)合低分子柑橘果膠處理SW620細胞48h后細胞的凋亡比例。
[0044] 五、PAC-1單用及聯(lián)合LCP處理細胞后細胞周期的變化
圖8為同濃度PAC-1單用及聯(lián)合低分子柑橘果膠處理SW116細胞不同時間后細胞周期變化；
表1-2為不同濃度PAC-1處理細胞24h后細胞周期變化； 表1-3為不同濃度PAC-1聯(lián)合LCP處理細胞24h后細胞周期變化。
[0045]表1-2不同濃度PAC-1處理細胞24h后細胞周期變化
表1-3不同濃度PAC-1聯(lián)合LCP處理細胞24h后細胞周期變化。
[0046] 六、PAC-1單用及聯(lián)合LCP作用SW116和SW620細胞后凋亡關(guān)鍵蛋白caspase-3、8、9、PARP、Rock-1的蛋白表達水平的情況
圖9顯示了PAC-1單用及聯(lián)合LCP處理SW116細胞后凋亡相關(guān)蛋白表達的變化。
[0047]綜上所示
1、PAC-1對實驗的5種人結(jié)腸癌細胞均表現(xiàn)出明顯的增殖抑制和誘導凋亡
2、PAC-1聯(lián)合LCP對人結(jié)腸癌細胞起協(xié)同殺傷作用；
3、PAC-1可以直接高效活化caspase-3；
4、線粒體途徑是PAC-1聯(lián)合LCP協(xié)同誘導人結(jié)腸癌細胞凋亡的機制；
5、PAC-1單用及聯(lián)合LCP可延長細胞的增殖周期。
[0048]LCP-對小鼠肝癌H22瘤株的抑制作用，CY為環(huán)磷酰胺。
[0049]實驗其間各組小鼠食水，毛色，活動狀態(tài)正常。小鼠接種H22細胞后五天，各組均可觸及皮下腫瘤，試驗其間LCP各給藥組小鼠活動狀態(tài)正常。第10天處死動物，解剖時發(fā)現(xiàn)，與NS組比較，LCP各組腫瘤浸潤范圍較小，深度局限，瘤體易剝離。LCP與CY聯(lián)合應用腫瘤抑制率明顯高于各組，具有統(tǒng)計學意義(P<0.001)用LCP各組小鼠體重與NS組比較無明顯差異，單CY組小鼠體重與NS組比較明顯低，進一表明LCP不具有毒性。與CY聯(lián)用減少毒性。
[0050]實驗結(jié)果表明：LCP對腫瘤生長的抑制作用呈劑量依賴關(guān)系，LCP與CY聯(lián)合應用腫瘤抑制率明顯高于各組，具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。
[0051]LCP-對小鼠宮頸癌U14瘤株的抑制作用，DOX為阿霉素。
[0052]試驗其間各組小鼠食水，毛色，活動狀態(tài)正常。小鼠接U14后細胞8天，給藥10天處死動物，解剖并計算抑瘤率，與NS組比較，LCP各組腫瘤浸潤范圍較小，深度局限，瘤體易剝離。LCP與DOX聯(lián)合應用腫瘤抑制率明顯高于各組，具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。
[0053]實驗結(jié)果表明：LCP對腫瘤生長的抑制作用呈劑量依賴關(guān)系，LCP與DOX聯(lián)合應用腫瘤抑制率明顯高于各組，具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。
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